1980-yillarning oxirida, ilg'or bo'lgani kabi, lazerli konfokal mikroskopiya katta nuqsonga ega: konfokal diafragma nafaqat fokus nuqtasidan tashqarida hosil bo'lgan floresansni blokirovka qiladi, balki biologik to'qimalar tomonidan tarqalgan fokus nuqtasi tomonidan hosil bo'lgan floresansni ham bloklaydi. floresan yig'ish samaradorligini pasayishi natijasida, va tasvirlash chuqurligi 100 mikrometrdan ortiq bo'lishi mumkin emas. Shu sababli, 1990-yillarda lazerli konfokal mikroskopiya va ikki fotonli qo'zg'alish texnologiyasini birlashtirgan ikki fotonli floresan mikroskopiya paydo bo'ldi. Ikki fotonli assimilyatsiya jarayonining qo'zg'alish to'lqin uzunligi odatda 680-1080 nm bio-optik oyna oralig'ida o'rnatiladi, bu ultrabinafsha nurlarning hujayralar yoki tirik organizmlarga zarar etkazishini oldini oladi va chuqurroq kirib boradi.
Hozirgi vaqtda eng ko'p ishlatiladigan ikki fotonli floresan mikroskop femtosekundli titaniumli tosh lazer bo'lib, u katta hajmli va qimmat bo'lib, hayot fanlari, kimyo va tibbiyot kabi turli sohalarda ikki fotonli flüoresan mikroskopiyani qo'llashni cheklaydi. Shunday qilib, tibbiy diagnostika kabi ba'zi sohalarda odamlar standart yorug'lik manbai sifatida ixcham va arzon sub-nanosekundli qattiq holatdagi lazerlardan foydalanishga harakat qilishdi.
Ikki fotonli qo'zg'alishning asosiy printsipi shundaki, lyuminestsent molekula yuqori foton zichligi ostida qo'zg'atilganda, u bir vaqtning o'zida ikkita uzun to'lqinli fotonni o'zlashtiradi va keyin qo'zg'alish sakrashlari va gevşeme jarayonlaridan keyin o'z-o'zidan flüoresan fotonlarni asosiy holatga qaytaradi. An'anaviy bitta fotonli qo'zg'atuvchi lyuminestsent mikroskopiya bilan taqqoslaganda, ikki fotonli qo'zg'atuvchi floresan mikroskopida optik signal hosil bo'lishi chiziqli bo'lmagan, qo'zg'atuvchi yorug'lik uzoqroq to'lqin uzunligi, eng yuqori quvvatli yorug'lik manbai va chiqarilgan lyuminestsent fotonlar to'lqin uzunligiga ega. qo'zg'alish to'lqin uzunligining yarmidan bir oz ko'proq.
Ikki fotonli floresan mikroskopiya yaqin infraqizil lazer yorug'lik manbasidan foydalanadi va uning chiziqli bo'lmagan tabiati konfokal diafragmani talab qilmaydi. Shuning uchun, konfokal mikroskopiya bilan solishtirganda, ikki fotonli floresan mikroskopiya quyidagi afzalliklarga ega:
- Katta tasvir chuqurligi va past optik shikastlanish;
- Konfokal diafragma talab qilinmaydi va floresan yig'ish samaradorligi sezilarli darajada yaxshilanadi;
- Yuqori fazoviy ruxsat va kontrast;
- Kichik qo'zg'alish diapazoni, kichik fototoksiklik va oqartirish;
- Emissiya va qo'zg'alish to'lqin uzunliklari bir-biridan uzoqda bo'lib, spektral bir-biriga yopishmaydi;
